Urutan genomik kebanyakan virus telah diketahui.Probe asid nukleik yang merupakan segmen pendek DNA yang direka bentuk untuk menghibridkan dengan DNA virus atau segmen RNA pelengkap.Tindak balas rantai polimerase (PCR) adalah teknik yang lebih cekap untuk pengesanan virus.Kaedah diagnostik throughput tinggi telah dibangunkan baru-baru ini.
A. Teknik hibridisasi asid nukleik
Hibridisasi asid nukleik, terutamanya termasuk Southern blotting (Southern) dan Northern blotting (Utara), adalah teknik baharu yang pesat membangun dalam bidang diagnostik virus.Rasional ujian hibridisasi adalah menggunakan segmen pendek DNA (dipanggil "probe") yang direka untuk menghibridkan dengan DNA virus atau segmen RNA pelengkap.Dengan pemanasan atau rawatan beralkali, DNA atau RNA sasaran bertali dua dipisahkan kepada helai tunggal dan kemudian digerakkan pada sokongan padu.Selepas itu, siasatan ditambah dan dihibridkan dengan DNA atau RNA sasaran.Memandangkan probe dilabelkan dengan isotop atau nuklida bukan radioaktif, DNA atau RNA sasaran boleh dikesan melalui autoradiografi atau oleh sistem biotin-avidin .Oleh kerana kebanyakan genom virus telah diklon dan disusun, ia boleh dikesan menggunakan jujukan khusus virus sebagai probe dalam spesimen.Pada masa ini, kaedah hibridisasi termasuk: dot blot , in situ hibridisasi dalam sel , DNA blotting(DNA) (Southern blot) dan RNA blotting(RNA) (Northern blot).
Teknologi B.PCR
Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, satu siri teknik amplifikasi asid nukleik in vitro telah dibangunkan berdasarkan PCR, untuk menguji virus yang tidak sensitif atau tidak boleh ditanam.PCR ialah kaedah yang boleh mensintesis jujukan DNA tertentu melalui tindak balas polimerase in vitro.Proses PCR merangkumi kitaran haba tiga langkah: denaturasi, penyepuhlindapan, dan lanjutan Pada suhu tinggi (93 ℃~95 ℃), DNA untai dua dipisahkan kepada dua helai DNA tunggal;kemudian pada suhu rendah (37℃~60℃), dua primer nukleotida yang disintesis menyelinap ke segmen DNA pelengkap;manakala pada suhu yang sesuai untuk enzim Taq (72 ℃), sintesis rantai DNA baru bermula dari hujung 3' primer menggunakan DNA pelengkap sebagai templat dan nukleotida tunggal sebagai bahan.Jadi selepas setiap kitaran, satu rantai DNA boleh dikuatkan kepada dua rantai.Mengulangi proses ini, setiap rantai DNA yang disintesis dalam satu kitaran boleh digunakan sebagai templat dalam kitaran seterusnya, dan bilangan rantai DNA digandakan dalam setiap kitaran, yang bermaksud pengeluaran PCR dikuatkan dalam kelajuan log 2n.Selepas 25 hingga 30 kitaran, pengeluaran PCR dikenal pasti melalui elektroforesis, dan produk DNA tertentu boleh diperhatikan di bawah cahaya UV (254nm).Untuk kelebihan kekhususan, kepekaan dan kemudahannya, PCR telah diterima pakai dalam diagnosis klinikal bagi banyak jangkitan virus seperti HCV, HIV, CMV dan HPV.Memandangkan PCR adalah sangat sensitif, ia boleh mengesan DNA virus pada tahap fg, operasi harus dijalankan dengan berhati-hati untuk mengelakkan positif palsu.Di samping itu, keputusan positif dalam ujian asid nukleik tidak bermakna terdapat virus berjangkit hidup dalam sampel.
Dengan aplikasi luas teknik PCR, teknik dan kaedah baharu dibangunkan berdasarkan teknik PCR untuk tujuan ujian yang berbeza.Sebagai contoh, PCR kuantitatif masa nyata boleh mengesan viral load;PCR in situ digunakan untuk mengenal pasti jangkitan virus dalam tisu atau sel;PCR bersarang boleh meningkatkan kekhususan PCR.Antaranya, PCR kuantitatif masa nyata telah dibangunkan dengan lebih pantas.Banyak teknik baharu, seperti probe hidrolisis TaqMan, probe hibridisasi, dan probe suar molekul, telah digabungkan ke dalam teknik PCR kuantitatif masa nyata, yang digunakan secara meluas dalam penyelidikan klinikal.Selain mengenal pasti viral load dalam cecair badan pesakit dengan tepat, kaedah ini juga boleh digunakan untuk mengesan mutan tahan dadah.Oleh itu, PCR kuantitatif masa nyata digunakan terutamanya dalam penilaian kesan kuratif dan pengawasan toleransi dadah.
C. Pengesanan pemprosesan tinggi asid nukleik virus
Untuk memenuhi keperluan untuk diagnosis cepat penyakit berjangkit baru yang timbul, pelbagai kaedah pengesanan pemprosesan tinggi, seperti cip DNA (DNA), telah diwujudkan.Untuk cip DNA, probe khusus disintesis dan dilekatkan pada cip silikon kecil dalam ketumpatan yang sangat tinggi untuk membentuk DNA probe microarray (DNA) yang boleh dihibridkan dengan sampel.Isyarat hibridisasi boleh digambarkan oleh mikroskop confocal atau pengimbas laser dan diproses selanjutnya oleh komputer dan set data yang besar mengenai gen berbeza boleh diperolehi.Terdapat dua jenis cip DNA."Cip sintesis" adalah seperti berikut: oligonukleotida khusus disintesis terus pada cip.Satu lagi ialah cip kolam DNA.Gen klon atau produk PCR dicetak dengan teratur pada slaid.Kelebihan teknologi cip DNA ialah pengesanan serentak sejumlah besar urutan DNA.Versi terkini cip pengesanan patogen boleh mengenal pasti lebih 1700 virus manusia sekaligus.Teknologi cip DNA menyelesaikan masalah kaedah hibridisasi asid nukleik tradisional dan mempunyai aplikasi yang sangat luas dalam diagnosis virus dan kajian epidemiologi.
Masa siaran: Dis-23-2020